ABSTRACT
The expression of a native form of the foot-and-mouth disease virus RNA polymerase was obtained. Two oligonucleotides of 66 base pairs were used to renuild the 5' end of the gene and to introduce the first methionine codon. The expression of the active polymerase in E. coli was achieved by inserting the gene before the tac promoter of the pKK223-3 plasmid
Subject(s)
DNA-Directed RNA Polymerases/genetics , Hand, Foot and Mouth Disease/genetics , Escherichia coli/genetics , Gene Expression Regulation, Viral , Amino Acid Sequence , Aphthovirus/enzymology , Base Sequence , Cloning, Molecular , Codon/genetics , DNA-Directed RNA Polymerases/immunology , DNA-Directed RNA Polymerases/metabolism , Molecular Sequence Data , Oligonucleotides/chemistry , Plasmids , Recombinant Proteins/genetics , Recombinant Proteins/immunology , RNA, Viral/geneticsABSTRACT
A RNA-polimerase (RNA-pol) do vírus da Febre Aftosa foi expressa em Escherichia coli de uma maneira controlável. Para isso um vetor de expressäo foi construído, clonando-se um cDNA do gene contendo o primeiro codon (AGT) e as sequências de Shine & Delgarno foi adicionada no terminal 5' do gene. Após termoinduçäo da cepa recombinante, a RNA-pol do virus da Febre Aftosa foi expressa, chegando a atingir 10% da proteína total da célula. Esta RNA-pol recombinante apresentava um peso molecular esperado (50Kda) assim como reaçäo cruzada em Wstern blot com soros anti RNA-pol (natural) e de bovinos convalescentes de Febre Aftosa. Um soro policlonal contra a RNA-pol recombinante foi capaz de inibir a atividade enzimática da RNA-pol natural. A expressäo da RNA-pol do vírus da Febre Aftosa em E. coli facilitará a análise da atividade enzimática desta molécula assim como tornará possível o desenvolvimento de um método diagnóstico eficiente e seguro para a Febre Aftosa